版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、第一節(jié) 病毒的純化,一、病毒純化前的準(zhǔn)備工作,繁殖病毒,利用生物學(xué)方法純化病毒,病毒感染的純化與診斷,二、標(biāo)本的采取與送檢,應(yīng)注意下列原則:1.對本身帶有雜菌 (如咽拭子、糞便) 或易受污染的標(biāo)本,要進行病毒分離培養(yǎng)時,應(yīng)使用抗生素。 2.因病毒在室溫中易失去活性,標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。 3.血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后各取血清,以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化。,三、病毒和病毒成份的提純,病毒純度的判定依據(jù):,
2、物理均一性; 病毒滴度與蛋白含量的比例; 免疫反應(yīng)單一而無非特異反應(yīng);結(jié)晶形成,在病毒不失活的前提下,從宿主細(xì)胞中釋放出來;病毒的純化可以應(yīng)用提純蛋白質(zhì)的技術(shù)方法;對大小、形狀和密度高度一致的病毒粒子, 可以采用分級分離的技術(shù)。,病毒提純的主要原則:,四、病毒萃取液的分級純化,沉淀法,中性鹽沉淀法,聚乙二醇沉淀法,有機溶劑沉淀法,等電點沉淀法,離 心 法,差速離心法,密度梯度離心法,速率區(qū)帶離心法,等密度區(qū)帶法,凝膠色譜
3、法,電泳法,病毒的感染單位(IU):能夠引起宿主或宿主細(xì)胞發(fā)生一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量;病毒效價:指單位體積(ml)病毒懸液的感染單位數(shù)目(IU/ml)或稱毒力 ;噬菌體效價(pfu) :又稱噬菌斑形成單位數(shù)指單位體積的噬菌體,能使感染細(xì)菌裂解,產(chǎn)生噬菌斑的數(shù)量。,因為病毒粒子對細(xì)菌細(xì)胞感染率不會超過100%,所以根據(jù)噬菌斑或空斑計算出的病毒粒子數(shù)總比噬菌體電鏡下觀察數(shù)低。,一、侵染力的測定,第二節(jié) 病毒的檢測,,半致死劑量
4、(LD50) : 使半數(shù)宿主細(xì)胞死亡的病毒劑量稱半致死劑量;半致感染劑量(ID50) :使半數(shù)宿主細(xì)胞發(fā)生感染的病毒劑量 ;半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50) :使半數(shù)組織培養(yǎng)物發(fā)生感染,產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)的病毒劑量。,二、病毒的培養(yǎng),1.動物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法,根據(jù)病毒種類不同,選擇敏感動物及適宜接種部位,如嗜神經(jīng)性病毒(狂犬病毒)可接種于小鼠腦內(nèi),痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。,2.雞胚培養(yǎng) 雞胚對多種
5、病毒敏感。一般采用孵化9~14天的雞胚,根據(jù)病毒種類不同,將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位,最常用的雞胚接種部位有:羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。,3.組織培養(yǎng)法 (tissueculture) 或細(xì)胞培養(yǎng) (cellculture)法 是將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱,為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,細(xì)胞的變化有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時可引起特有的細(xì)胞病變,稱為細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)。常見的變化有
6、細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于細(xì)胞膜,可使鄰近的細(xì)胞相互融合,形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞漿或核內(nèi)的包涵體。,病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo),2.紅細(xì)胞吸附 (hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細(xì)胞后,由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA),具有吸附脊椎動物 (豚鼠、雞、猴等)
7、 紅細(xì)胞的能力,這一現(xiàn)象稱紅細(xì)胞吸附,常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的抗血清,則能中和細(xì)胞膜上的HA,HAd不再發(fā)生,稱紅細(xì)胞吸附抑制試驗。,3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細(xì)胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于測出的變化(如HAd),但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)疹病毒感染Vero細(xì)胞時CPE不明顯,但它能干擾后感染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖,從而阻抑后者所特有的CPE。,4.
8、細(xì)胞代謝的改變 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變,說明細(xì)胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標(biāo)。,(二) 病毒的數(shù)量與感染性測定,1.蝕斑測定 是一種檢查和準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后,再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂,使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴散。結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料
9、(如中性紅) 染色,則活細(xì)胞著色,受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色,形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的,稱作蝕斑形成單位 (plaque forming unit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU/ml表示。,2.50%組織細(xì)胞感染量 (TCID50)測定法 該方法是測定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生感染的最小量。一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋,分別接種細(xì)胞,經(jīng)一定時間
10、后觀察CPE、血細(xì)胞吸附等指標(biāo),以最高稀釋度能感染50%細(xì)胞的量為終點。最后用統(tǒng)計方法計算出50%組織細(xì)胞感染量。,三、病毒感染的血清學(xué)診斷,原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體,故須待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。 另外,在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)注意病程,必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清 (雙份血清) 進行血清學(xué)試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時,才有診斷意義。,2.中和試驗(ne
11、utralizing test,NT test),是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。 中和抗體是作用于病毒表面抗原 (衣殼或包膜) 的抗體,同種不同型病毒間一般無交叉,特異性高,而且抗體在體內(nèi)維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中,也可能因以前有過隱性感染所致。因此,中和試驗適用于人群免疫情況的調(diào)查,在臨床診斷上較少使用。,1.免疫沉淀法,使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。,3.補體
12、結(jié)合試驗 (complement fixation test,CF test),如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的抗體(或抗原),則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補體;再加入指示系統(tǒng)時,由于反應(yīng)液中已沒有游離的補體而不出現(xiàn)溶血,是為補體結(jié)合試驗陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體(或抗原),則在液體中仍有游離的補體存在,當(dāng)加入指示系統(tǒng)時會出現(xiàn)溶血,是為補體結(jié)合試驗陰性。因此補體結(jié)合試驗可用已知抗原來檢測相應(yīng)抗體,或用已知抗體來檢測相應(yīng)抗原。,補體結(jié)合
13、試驗圖示,受檢系統(tǒng),指示系統(tǒng),溶血反應(yīng),補體結(jié)合試驗,1、僅有抗原或抗體,,,,,,,,補體,紅細(xì)胞,溶血素,陽性,陰性,2、抗原抗體反應(yīng),,,,,,紅細(xì)胞,溶血素,陰性,陽性,抗原,抗體,補體,抗原/抗體,,,,,,,5. 酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA ),以待測抗原(或抗體)與酶標(biāo)抗體(或抗原)的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ),通過酶活力測定來確定抗原(或抗體)含量。,4
14、.凝膠擴散法,Ag和Ab相遇形成沉降帶。,ELISA的基本類型,先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上,并保持其免疫活性。測定時,將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色,進行定性或定量測定。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同,有競爭法、雙抗體夾心法、間接法三種類型的常用方法。,此法可用于抗原和半抗原的定量測定,也可用于測定抗體。以測
15、定抗原為例, 將抗原吸附于固相載體;加入待測抗原和一定量特異性抗體,使固相抗原與待測抗原二者競爭與抗體結(jié)合;經(jīng)過洗滌分離,最后結(jié)合于固相的抗體與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。,競爭法,此法常用于測定抗原, 將已知抗體吸附于固相載體, 加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌,加入酶標(biāo)抗體和底物進行測定。,雙抗體夾心法,此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體,加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后,加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶
16、標(biāo)抗抗體)和底物進行測定。,間接法,四、病毒核酸檢測,雜交法 用于病毒檢測的有斑點雜交、細(xì)胞內(nèi)原位雜交 、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。 PCR法 目前多數(shù)病毒基因已通過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列,使得DNA擴增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診斷技術(shù)之一。,反轉(zhuǎn)錄PCR,基因芯片技術(shù),又稱DNA芯片、生物芯片(biochip)。 其原理是:將已知的生物分子探針或基因探針,大規(guī)?;蛴行蚺挪加谛K硅片等載體上,與待測樣品中
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 腸道病毒71型的檢測及初步純化.pdf
- 質(zhì)粒dna的提取、純化和電泳檢測
- 花生條紋病毒分子變異分析和馬鈴薯Y病毒蛋白的表達純化.pdf
- CSISV的部分特性研究及病毒純化和中和試驗.pdf
- 帶組氨酸標(biāo)簽的登革病毒2型和4型病毒樣顆粒的表達鑒定和純化.pdf
- 狂犬病毒核蛋白和糖蛋白基因的克隆、表達、純化及間接ELISA檢測方法的建立.pdf
- 對蝦桿狀病毒1197基因的表達和產(chǎn)物純化的研究.pdf
- partⅰ.人巨細(xì)胞病毒重組蛋白的表達純化和免疫學(xué)性質(zhì)研究partⅱ.風(fēng)疹病毒igg抗體檢測方法的研究
- 海洋源金屬硫蛋白的提取、純化和檢測.pdf
- 豬α、γ干擾素的原核表達、純化及抗病毒活性初步檢測.pdf
- 魚類過敏蛋白的檢測分析、分離純化和分子克隆.pdf
- 腸道病毒71型的層析純化.pdf
- CA16病毒的分離鑒定檢測及規(guī)?;囵B(yǎng)與純化方法研究.pdf
- arp病毒的檢測定位和防范研究大學(xué)論文
- 彩色馬蹄蓮病毒的分子檢測和鑒定.pdf
- 輪狀病毒滅活疫苗純化、滅活及抗原定量檢測方法的建立.pdf
- 腸道病毒71型病毒樣顆粒的制備、純化與鑒定.pdf
- 病毒檢測題
- 番茄黑環(huán)病毒和建蘭花葉病毒檢測方法的研究.pdf
- 蟲媒病毒和呼吸道病毒Array-ELISA檢測方法的建立.pdf
評論
0/150
提交評論